本发明涉及一种来自蛇类的利钠肽以及编码该多肽的基因。本发明所述的利钠肽是一种来源于东非绿曼巴蛇的利钠肽。本发明所述的利钠肽是一种全新的利钠肽,是利钠肽家族的新成员,称为GNP,即G型利钠肽。本发明还提供了重组利钠肽的制备方法。本发明提供的利钠肽,包括重组利钠肽和人工合成利钠肽,均可应用于制备治疗急性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、急性心肌梗死冠状动脉介入术后患者、慢性心力衰竭、老年急性前壁心肌梗死合并收缩性心力衰竭患者的药物。
1.一种来源于东非绿曼巴蛇(Dendroaspisxa0angusticeps)的利钠肽,其氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:xa01所示。
2.编码如权利要求1所述的利钠肽的基因。
3.根据权利要求2所述的基因,其核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NO:xa02所示。
4.包含如权利要求3所述的基因的重组表达载体。
5.用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
6.从如权利要求5所述的转化体中获得的重组利钠肽。
7.制备如权利要求6所述的重组利钠肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:培养包含如权利要求5所述的转化体,回收所表达的重组利钠肽。
8.如权利要求1所述的利钠肽在制备治疗急性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、急性心肌梗死冠状动脉介入术后患者、慢性心力衰竭、老年急性前壁心肌梗死合并收缩性心力衰竭患者的药物的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于:所述的利钠肽是重组利钠肽或者人工合成利钠肽。
10.一种药物组合物,其特征在于:包括根据权利要求1所述的利钠肽或者根据权利要求6所述的重组利钠肽,以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂;所述药物组合物为注射剂或者冻干制剂。技术领域
本发明涉及一种利钠肽,尤其是涉及一种来自蛇类的利钠肽,以及编码该多肽的基因。
背景技术
利钠肽(Natriureticxa0Peptide,xa0NP)是指一类具有较强排钠、利尿、扩血管等生物活性的多肽。这些多肽具有遗传上的同源性和相同的受体系统。目前,从哺乳类动物中获得的利钠肽包括:心钠肽、脑钠肽和C型利钠肽。心钠肽主要由心房肌细胞分泌,脑钠肽主要由心室肌细胞分泌,C型利钠肽主要由血管内皮细胞分泌并在局部发挥血管扩张和抗增殖作用。1981年加拿大科学家dexa0Bold等发现大鼠的心脏提取液具有很强的利钠、利尿作用。一年后,他们确认其有效组分是多肽。在随后的2-3年中,利钠肽家族中的第一个成员心钠肽的结构被确认。心钠肽(atrialxa0natriureticxa0peptide,ANP)又称为“心钠素”或“心房利钠肽”,是由心房肌细胞合成并释放的肽类,根据其英文缩写又称为“A型利钠肽”。人体中的ANP由28个氨基酸残基组成。ANP的主要作用是使血管平滑肌舒张和促进肾脏排钠、排水。当心房壁受牵拉时可刺激心房肌细胞释放ANP。ANP对肾脏的作用主要有以下几方面:1、对肾小球滤过率的影响。ANP通过第二信使cGMP使血管平滑肌胞质钙离子浓度下降,使入球小动脉舒张,肾小球滤过率增大;2、对集合管的影响。ANP通过cGMP使集合管上皮细胞管腔膜上的钠通道关闭,抑制NaCl的重吸收;3、对其他激素的影响。ANP还抑制肾素、醛固酮和血管升压素的分泌。1988年日本科学家Sudoh等从猪脑分离出利钠肽家族中的第二个成员——脑钠肽。脑钠肽(Brainxa0Natriureticxa0Peptide,BNP)又称“脑钠素”,根据其英文缩写又称为“B型利钠肽”。在心力衰竭的病人血液中,脑钠肽、心钠肽都明显升高。脑钠肽实际上主要来源于心室。BNP具有重要的病理生理学意义,它可以促进排钠、排尿,具较强的舒张血管作用,可对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的缩血管作用,同ANP一样是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统。心功能障碍能够极大地激活利钠肽系统,心室负荷增加导致BNP释放。C型利钠肽(C-typexa0Natriureticxa0Peptide,CNP)是Sudoh等于1990年从猪脑中提取的第3个利钠肽家族成员,因其具有较强的抑制血管重构和一定的扩血管作用而受到广泛的关注。研究表明,利钠肽的核心结构是一个由17个氨基酸形成的通过一对半胱氨酸二硫键连接的环状结构,该核心结构对于利钠肽与受体的结合以及其生物活性是非常重要的。研究表明,利钠肽的生理药理机理是:作用于心血管系统和泌尿系统;与血管平滑肌及内皮细胞的鸟苷酸环化酶受体结合,刺激细胞内第二信使cGMP浓度升高;促进平滑肌细胞舒张;扩张动脉和静脉;降低体循环血管阻力;增加血管的通透性;增加静脉容量;改善血流动力学;降低全身动脉压、右房压、肺毛细血管楔压;降低心脏前后负荷;是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的天然拮抗剂;拮抗内皮素、去甲肾上腺素和醛固酮的活性;扩张肾小球的入球小动脉、收缩出球小动脉,增加肾小球毛细血管阻力,增加肾小球滤过率,促进肾小管钠和水的转运,发挥排钠、利尿作用。利钠肽的特点是:没有正性肌力作用;不强制性地增强心肌的收缩能力;不增加心肌耗氧量;没有目前扩血管药和利尿药物对于血压和心率改变的副作用。因此,利钠肽的潜在临床适应症包括:急性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、急性心肌梗死冠状动脉介入术后患者、慢性心力衰竭、老年急性前壁心肌梗死合并收缩性心力衰竭患者等。目前,国内外已经开发出重组人脑钠肽药物。这些药物是人工合成的产品,与心室肌分泌的天然脑钠肽具有相同的32个氨基酸序列。美国Scios公司(现归属强生公司)于2001年9月上市销售奈西立肽(Nesiritide),商标名“Natrecor”,它是首个上市的重组人脑利钠肽(rhBNP)。奈西立肽具有明确的扩血管和排钠利尿作用,已在美国获准用于治疗急性失代偿性心力衰竭。临床研究表明,奈西立肽可改善心力衰竭病人的血流动力学,改善心力衰竭病人的临床症状。xa0我国目前也有两家企业生产和销售研发重组人脑利钠肽药品,一家是西藏诺迪康股份有限公司(上市公司简称:西藏药业),商品名“新活素”,另一家是苏州苏兰生物医药科技开发有限公司,商品名“布罗纳泰”,均为冻干粉针剂。这两种药品均在2005年获批上市销售,是心血管类国家一类新药,用于治疗休息或轻微活动时呼吸困难的急性心力衰竭患者。据报道,“新活素”于2010年4月完成四期临床试验,5月底进入国家首部《急性心力衰竭诊断和治疗指南》。据报道,美国每年心衰的发病率为0.23-0.27%,而我国每年因急性心力衰竭而住院的患者人数不少于200万人,并且每年以10%的比例增加,随着生活水平继续上升和人口老龄化,患病人数将持续上升。重组人脑利纳肽为急性心衰的抢救用药,其中90%以上的患者可以使用此药。在非哺乳类动物中,也发现了类似结构和功能的利钠肽,例如,Schweitz等于1992年从东非绿曼巴蛇(Dendroaspisxa0angusticeps,又称Greenxa0Mamba)的蛇毒中分离得到D型利钠肽(Dendroaspisxa0Natriureticxa0Peptide,DNP);Ho等于1997年从南美银环蛇(Micrurusxa0corallinus)的蛇毒中分离得到M型利钠肽(Micrurusxa0Natriureticxa0Peptide,MNP),从鳗鱼心脏中分离到V型利钠肽(Ventriclexa0Natriureticxa0Peptide,VNP)(Takei等,1991)。相比于ANP、BNP和CNP,其他利钠肽的研究报道较少。东非绿曼巴蛇(Dendroaspisxa0angusticeps)为眼镜蛇科曼巴蛇属的一种,被认为是目前爬行速度最快的蛇之一,也是非洲草原最令人敬畏的毒蛇之一,被称为“东非死神”。绿曼巴蛇浑身绿得像一根翠竹,头和身子一般细,能灵活的在树枝间跳跃。绿曼巴蛇的毒素不及黑曼巴蛇(Dendroaspisxa0polylepis),但它们同样继承了快速运动的先天优势,成为一种以速度和毒液取胜的蛇。因此,本发明致力于从东非绿曼巴蛇的蛇毒腺组织中寻找新的利钠肽。
发明内容
本发明的目的是提供了一种新的利钠肽,它是从东非绿曼巴蛇(Dendroaspisxa0angusticeps,又称Greenxa0Mamba)的蛇毒腺组织中的天然多肽的基础上获得的多肽。本发明所述的利钠肽是一种来源于东非绿曼巴蛇(Dendroaspisxa0angusticeps)的利钠肽,其氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:xa01所示,全长125个氨基酸,其中包括25个氨基酸的信号肽和38个氨基酸的成熟肽。将本发明所分离得到的成熟利钠肽与同样来源的已报道的DNP成熟肽相比,它们均为38个氨基酸,但两者间的同源性仅为36.80%。本发明所述的利钠肽虽然在氨基酸序列上不同于其他已知的利钠肽,但同样具有利钠肽的核心结构即由17个氨基酸形成的通过一对半胱氨酸二硫键连接的环状结构,因此,本发明所述的利钠肽是一个全新的天然利钠肽,是利钠肽家族的新成员。本发明将该全新的利钠肽称为GNP(G来自Greenxa0Mamba),也就是G型利钠肽。为简化说明,以下用GNP表示本发明所述的利钠肽。根据现有技术,可以从本发明所公开的氨基酸序列中推导出编码本发明所述的利钠肽的基因序列,因此,所有可以编码本发明所述的利钠肽即GNP的基因均落入本发明的保护范围之内。发明人也从构建的蛇毒腺组织cDNA文库中获得编码GNP的基因序列。优选地,编码本发明所述的利钠肽即GNP的基因,其核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NO:xa02所示。SEQxa0IDxa0NO:xa02显示了发明人从东非绿曼巴蛇的蛇毒腺组织新鲜分离的mRNA构建cDNA文库然后克隆得到的编码GNP的全长cDNA序列,其中,5’-UTR(5’非翻译区)为150bp,3’-UTR(3’非翻译区)为160bp,开放阅读框编码125个氨基酸和1个终止子,包括25个氨基酸的信号肽和38个氨基酸的成熟肽。根据本发明的一个具体实施例,利用基因工程的方法,在大肠杆菌表达系统中表达并纯化出重组GNP多肽。在该实施例中,采用含GST(谷胱甘肽S-转移酶)的pGEX-6P-3载体,表达出GNP蛋白前体,并裂解得到GNP成熟肽。本领域技术人员可以根据本发明所揭示的原理和方法,采用任意已知的原核或真核表达系统来表达出重组GNP多肽。因此,包含本发明所述的编码GNP的基因的重组表达载体,以及采用该重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体,以及从所述的转化体中获得的重组利钠肽,均落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员可以根据本发明所揭示的原理和方法,针对任意的采用包含本发明所述的编码GNP的基因的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体,可选择合适的培养条件培养所述的转化体,并通过合适的提取方法回收所表达的重组利钠肽即重组GNP。这些制备本发明所述的重组GNP的方法均落入本发明的保护范围之内。根据本发明的具体实施例,本发明所述的GNP被应用于PC12细胞(大鼠肾上腺细胞)、RASMC细胞(大鼠主动脉平滑肌细胞)和HCD细胞(人肾皮质集合管细胞),研究该多肽刺激cGMP分泌的效果。PC12和HCD细胞均主要表达NPRA(利钠肽受体A),而RASMC细胞则主要表达NPRB(利钠肽受体B)。根据本发明所提供的细胞水平的实验结果,可以惊喜地发现,GNP在上述三种细胞中均可有效刺激cGMP分泌,也就是,GNP可激活两种利钠肽受体即NPRA与NPRB,虽然效果稍低于ANP和CNP。因此,本发明所述的GNP具有较强排钠、利尿、扩血管等生物活性。类似于前述的“奈西立肽”和“新活素”,本发明提供的利钠肽,包括重组利钠肽和人工合成利钠肽,均可应用于制备治疗急性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、急性心肌梗死冠状动脉介入术后患者、慢性心力衰竭、老年急性前壁心肌梗死合并收缩性心力衰竭患者的药物。本发明还提供了一种药物组合物,它包括本发明所述的利钠肽,包括重组利钠肽和人工合成利钠肽,以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。根据本发明所述的药物组合物的进一步特征,所述药物组合物可以是注射剂,也可以是冻干制剂。本发明对于所述利钠肽GNP的生理药理研究以及其开发应用确立了良好的基础。
附图说明
图1是本发明所述的利钠肽即GNP的全长cDNA序列以及推导的氨基酸序列的分析图。图2A是ANP(1×10^-6xa0M)在PC12细胞中促使cGMP分泌的柱形图。图2B是GNP(1×10^-6xa0M)在PC12细胞中促使cGMP分泌的柱形图。图3是五种利钠肽在PC12细胞中促使cGMP分泌的曲线图。图4显示GNP(1×10^-6M)在RASMC细胞中促使cGMP分泌的柱形图。xa0图5显示了五种利钠肽在RASMC细胞中促使cGMP分泌的曲线图。图6A是ANP(1×10^-6xa0M)在HCD细胞中促使cGMP分泌的柱形图。图6B是GNP(1×10^-6xa0M)在HCD细胞中促使cGMP分泌的柱形图。图7是五种利钠肽在HCD细胞中促使cGMP分泌的曲线图。图8是pGEX-6P-3载体的图谱。图中箭头显示了前切割蛋白酶(Prescissionxa0Protease)的切割位点。图9是GNP蛋白前体的SDS-PAGE凝胶电泳图。在该图中,泳道1是蛋白质分子量标准;泳道2是从前切割蛋白酶消化柱内洗脱的第一蛋白片段;泳道3是第二蛋白片段;泳道3是第三蛋白片段。
具体实施方式
实施例一:GNP的cDNA克隆和基因分析xa0xa0xa0xa0采用Invitrogen公司的快速mRNA提取试剂盒从东非绿曼巴蛇的新鲜分离的蛇毒腺组织中提取得到mRNA,然后采用Clontech公司的SMART^TMxa0cDNA文库构建试剂盒构建蛇毒腺组织的cDNA文库。该试剂盒采用5’和3’RACE技术来进行cDNA末端快速克隆。5’RACE的引物:SEQxa0IDxa0NO:xa035’-TGGTCGATCTTGTGGCCGAAGCAGCCAT-3’xa0。3’RACE的引物:SEQxa0IDxa0NO:xa045’-TAGACTCGCGTCGTATGAAGGGGCTGGA-3’xa0。切胶回收RACE产物,得到一种新的利钠肽即本发明所述的GNP的全长cDNA序列。GNP的全长cDNA序列以及推导的氨基酸序列可参见图1和序列表。该cDNA全长718bp,其核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NO:xa02所示。其中,5’-UTR(5’非翻译区)为150bp,3’-UTR(3’非翻译区)为160bp,开放阅读框编码125个氨基酸和1个终止子,包括25个氨基酸的信号肽和38个氨基酸的成熟肽。本发明所述的利钠肽即GNP的氨基酸序列(即成熟肽序列)为SEQxa0IDxa0NO:1,其修饰产物,例如部分氨基酸发生去除、取代、修饰或加成后所产生的产物,也包括在本发明所述的保护范围之内。xa0xa0xa0xa0为证实在第一链cDNA中存在上述全长的cDNA,采用基于5’端和3’端设计的两个引物,以第一链cDNA为模板进行PCR。正向引物:SEQxa0IDxa0NO:xa055’-CTATAGGGCAAGCAAGCAGTGGTAAC-3’反向引物:SEQxa0IDxa0NO:xa065’-CTGCGGATGGGGTGTGGGGTGTCC-3’xa0xa0xa0xa0将PCR产物克隆后进行测序,结果确认GNP的全长cDNA确实存在于蛇毒腺组织中。在GNP的基因分析中有以下值得关注之处:1.xa0在3’-UTR存在两个ATTTA结构域,这种序列曾在BNP和CNP的cDNA中发现(但在ANP中不存在),其功能是使mRNA不稳定,并被认为是设计用于对生理反应做出快速反应。2.xa0GenBankxa0BLAST检索显示,在GNP与MNP的信号肽之间有相当显著的相似性,25个氨基酸中有23个相同。这大概是因为它们所来自的东非绿曼巴蛇与南美银环蛇都属于毒蛇。根据GNP基因推导的理论氨基酸序列(一级结构)为:KSTPDGCFGHKLDPIGSHSGLGCPGAGPHPKPTPGAGR(38aa)。在GNP的蛋白分析中有以下值得关注之处:1.xa0尽管GNP与DNP均为38个氨基酸,且都来自东非绿曼巴蛇,但两者间的同源性仅为36.80%。GNP与其他已知的利钠肽在序列上的区别更大。2.xa0在信号肽与成熟肽之间,GNP与DNP存在一个非常相似的氨基酸序列,在26个氨基酸中有24个相同,这大概是因为它们所来自的东非绿曼巴蛇的毒腺。3.xa0与其他利钠肽的报道类似,GNP的核心结构也是由17个氨基酸形成的通过一对半胱氨酸二硫键连接的环状结构。综上所述,本发明所得到的GNP是一个全新的天然利钠肽,是利钠肽家族的新成员。实施例二:GNP蛋白的人工合成和分析发明人根据实施例一的分析结果进行GNP蛋白的人工合成,并委托上海生化所对发明人所提供的合成多肽样品进行分子量分析(质谱法)、纯度分析(HPLC法)、N端测序测试分析、多肽分子内二硫键是否存在和二硫键定位分析。1.xa0分子量分析样品状态:固体。检测方法:质谱法。所用主要仪器:质谱仪。分析测试结果:质谱分子量xa03690.5146xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa03690.5146理论分子量xa03689.7900xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa03689.79xa0xa0xa0xa0xa0。2.xa0纯度分析样品状态:固体。检测依据:中国药典2010版三部附录IIIxa0B高效液相色谱法。所用主要仪器:HPLC(Agilent,1200型)。分析测试结果:样品经HPLC分析,以峰面积归一法计算样品主峰纯度为:97.34%(反相)。3.xa0N端测序测试分析实测序列与理论序列比对如下:理论序列:K-S-T-P-D-G-C-F-G-H-K-L-D-P-I-G-S-H-S-G-L-G-C-P-G-A-G-P-H-P-K-P-T-P-G-A-G-Rxa0(38aa);实测序列:NH2-K-S-T-P-D-G-C-F-G-H-K-L-D-P-I-G-S-H-S-G-L-G-C-P-G-A-G-P-H-P-K-P-T-P-G-A-G-Rxa0(38aa)。4.xa0多肽分子内二硫键是否存在和二硫键定位分析二硫键是重要的蛋白质翻译后修饰形式,也是一种比较特殊的修饰。蛋白质分析通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起,对蛋白质分子保持正确的高级结构,维持必要的生物活性至关重要。因此在蛋白质类药物的生物化学分析中,二硫键一直是关心的重点。在本发明中,结合多肽分子在溶液内酶解和xa0LCMSMS,对供试品的二硫键配对方式进行了分析,明确了供试品的各种链内二硫键配对方式,并提供了确定二硫键配对方式的试验证据,包括一级和二级质谱数据等。供试品状态:固体。理论配对方式为:Cys7与Cys23xa0xa0。实验仪器:1)xa0xa0xa0xa0LTQ-velos,Thermofinnigan2)xa0xa0xa0xa0MDLC,GExa0Healthcare3)xa0xa0xa0xa04800xa0MALDI-TOF/TOF,xa0xa0xa0xa0ABxa0SCIEXxa0。实验原理:本实验中对二硫键的检测,将xa0MALDI-TOF/TOFxa0和LCMSMSxa0技术相结合,从分子量,一级和二级离子等方面准确有效的对二硫键进行确证。一方面,使用ABxa0SCIEXxa04800xa0MALDI-TOF/xa0TOF对供试品相对分子质量进行测试,准确可靠的获得蛋白质相对分子质量信息。另一方面,使用LCMSMSxa0质谱技术对二硫键配对的多肽分子进行解析,结合软件和附加的人工解析,并进行了还原前后目标二硫键多肽分子的色谱质谱图分析,高度准确可靠的获得了二硫键配对的信息。实验方法1)xa0xa0xa0xa0chymotrypsin酶解及还原。2)xa0xa0xa0xa0MALDI-TOF/TOF点样。3)xa0xa0xa0xa0MALDI-TOF/TOF测试样品:在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。4)xa0xa0xa0xa0MALDI-TOF/TOF质谱数据及图谱处理4800xa0MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000xa0Seriesxa0Explorerxa0V3.5软件导出。5)毛细管高效液相色谱酶解后的肽段通过GE公司的Ettanxa0MDLC进行分离,再通过Thermoxa0LTQ-Velos进行测试。6)LCMSMS质谱鉴定。7)LCMSMS质谱数据处理肽段质谱图谱先由计算机软件查库匹配,再由人工匹配验证肽段二级质谱,最后确定二硫键的链接方式。实验结果和分析本实验首先通过MALDIxa0xa0TOF/TOF技术确定多肽分子的相对分子质量并对MS2图谱进行序列确证。分子量的检测结果为:还原前分子量约为3688.75Da;IAA还原及烷基化后分子量约为3804.98Da;以上还原前后的分子量测试结果与该多肽的理论分子量相符。为进一步确定该多肽分子的氨基酸序列是否与理论序列一致,通过采集二级图谱,并将MS2图谱与理论序列进行匹配来验证,匹配结果发现该二级图谱与供试品多肽理论序列吻合。进一步通过人工匹配MS2图谱,确定二硫键的链接方式。通过匹配发现供试品中存在和理论配对方式相符的1对二硫键,xa0为:Cys7~Cys23。由于现代生物质谱的灵敏度非常高,在二硫键分析中的微量错配也可能在MS2鉴定数据中得到假阳性的结果,因此对需要确定的二硫键配对的色谱质谱图(XICs)的效果的确认工作就显得很重要。本实验对二硫键配对形式的XICs进行了分析并计算还原前后信号分峰面积,进一步对理论配对的二硫键进行确证。从XICs图谱分析可得,由MS2图谱初步确认的二硫键Cys7~Cys23xa0所在肽段分子信号强度在还原后较还原前下降显著,进一步说明二硫键Cys7~Cys23xa0的确存在,而不是假阳性的结果。xa0结论综上所述,供试品GNP多肽(批号:GNP20120817)中存在1对与理论相符的二硫键,为Cys7~Cys23xa0。实施例三:在PC12细胞上的cGMP分泌实验实验材料:PC12细胞(一种大鼠肾上腺细胞),商业购买。根据已有报道,在PC12细胞中,NPRA(利钠肽受体A)与NPRB(利钠肽受体B)的比例是3:1,也就是,以NPRA为主。本实验研究了由包括GNP在内的5种利钠肽家族成员在PC12细胞上对cGMP分泌的刺激效果。其中,GNP是来自实施例二所人工合成的样品,其他4种利钠肽,均来源于商业购买或者学者馈赠。实验一:在24孔培养板上培养PC12细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入1×10^-6M的ANP和GNP。在每个时间点取出6个不同孔的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图2A与图2B分别显示ANP(1×10^-6M)与GNP(1×10^-6M)在PC12细胞中促使cGMP分泌的动态过程。经比较可见,在给药后2-4小时,cGMP浓度都达到峰值,虽然GNP实验中的峰值比ANP实验中的峰值低,但在达到峰值后,GNP实验的药效消减比ANP实验更慢(在8小时后仍维持较高峰值)。实验二:在24孔培养板上培养PC12细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入每个浓度的ANP、BNP、CNP、DNP和GNP,在2小时培育后,取出孔内的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图3显示了五种利钠肽在PC12细胞中促使cGMP分泌的曲线。如图所示,在低浓度时,各种利钠肽之间的刺激效果相差不大;在利钠肽浓度达到1×10^-9M以上时,各自的促cGMP分泌效果开始分化,而GNP的刺激能力居中游,虽低于ANP、BNP和DNP,但显著高于CNP。本实施例的上述实验证明,GNP可有效作用于NPRA以刺激cGMP分泌。实施例四:在RASMC细胞上的cGMP分泌实验实验材料:RASMC细胞(一种大鼠主动脉平滑肌细胞),商业购买。根据已有报道,在RASMC细胞中,NPRA与NPRB的比例是1:3,也就是,以NPRB为主。本实验研究了由包括GNP在内的5种利钠肽家族成员在RASMC细胞上对cGMP分泌的刺激效果。实验一:在24孔培养板上培养RASMC细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入1×10^-6M的ANP和GNP。在每个时间点取出6个不同孔的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图4显示GNP(1×10^-6M)在RASMC细胞中促使cGMP分泌的动态过程。由图可见,在给药后2-4小时,cGMP浓度达到峰值,在8小时后仍维持较高峰值,药效消减较慢。由于ANP只作用于NPRA,所以在RASMC细胞实验中无效果。实验二:在24孔培养板上培养RASMC细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入每个浓度的ANP、BNP、CNP、DNP和GNP,在2小时培育后,取出孔内的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图5显示了五种利钠肽在RASMC细胞中促使cGMP分泌的曲线。如图所示,在低浓度时,各种利钠肽之间的刺激效果相差不大;在利钠肽浓度达到1×10^-8M以上时,各自的促cGMP分泌效果开始分化,而GNP的刺激能力居中游,虽低于CNP,但显著高于ANP、BNP和DNP。本实施例的上述实验证明,GNP可有效作用于NPRB以刺激cGMP分泌。实施例五:在HCD细胞上的cGMP分泌实验实验材料:HCD细胞(一种人肾皮质集合管细胞),商业购买。根据已有报道,在HCD细胞中,NPRA(利钠肽受体A)与NPRB(利钠肽受体B)的比例是3:1,也就是,以NPRA为主。本实验研究了由包括GNP在内的5种利钠肽家族成员在PC12细胞上对cGMP分泌的刺激效果。实验一:在24孔培养板上培养HCD细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入1×10^-6M的ANP和GNP。在每个时间点取出6个不同孔的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图6A与图6B分别显示ANP(1×10^-6M)与GNP(1×10^-6M)在HCD细胞中促使cGMP分泌的动态过程。经比较可见,在给药后2-4小时,cGMP浓度都达到峰值,虽然GNP实验中的峰值比ANP实验中的峰值低,但在达到峰值后,GNP实验的药效消减比ANP实验更慢(在8小时后仍维持较高峰值)。实验二:在24孔培养板上培养HCD细胞至每孔1×10⁶细胞,分别加入每个浓度的ANP、BNP、CNP、DNP和GNP,在2小时培育后,取出孔内的培养液进行cGMP浓度分析(采用免疫测定法)。图7显示了五种利钠肽在HCD细胞中促使cGMP分泌的曲线。如图所示,在低浓度时,各种利钠肽之间的刺激效果相差不大;在利钠肽浓度达到1×10^-9M以上时,各自的促cGMP分泌效果开始分化,而GNP的刺激能力居中游,虽低于ANP、BNP和DNP,但显著高于CNP(几乎没效果)。本实施例的上述实验证明,GNP可有效作用于NPRA以刺激cGMP分泌。综合实施例二至四的结果分析,在NPRA占优势的细胞中,ANP、BNP、DNP的刺激效果较明显,而在NPRB占优势的细胞中,CNP的刺激效果较明显,这说明已知的利钠肽家族成员都是偏重于某一种受体。可以惊喜地发现,本发明所述的GNP对两种受体NPRA和NPRB的作用效果都很明显,这表明新的GNP是一种可同时结合两种受体NPRA和NPRB而发挥作用的利钠肽。实施例六:重组GNP的制备本实施例利用基因工程的方法,在大肠杆菌表达系统中表达出重组GNP多肽。采用在大肠杆菌(E.xa0coli)中高效表达融合蛋白的质粒,即含GST(谷胱甘肽S-转移酶)的pGEX-6P-3载体,该载体是已商品化的质粒,其图谱参见图8。该载体表达的蛋白是由26xa0kDaxa0GST与目标蛋白组成的融合蛋白。该载体在GST结构域和多克隆位点之间编码了PreScission蛋白酶的识别位点,有一个前切割蛋白酶(Prescissionxa0Protease)识别位点,用于从融合蛋白中特异性切割目标蛋白。利用PCR方法在GNP蛋白前体(preproGNP)基因的两端加上BamHxa0I和Notxa0I酶切位点,因此将插入pGEX-6P-3载体。将GNP蛋白前体基因与GST在pGEX-6P-3载体内融合后,在大肠杆菌BL21细胞内高水平诱导表达。诱导剂为IPTG,也可通过盐来诱导,这样可实现低成本的大量表达。然后,利用谷胱甘肽琼脂糖(Glutathionexa0Sepharose)填料通过亲和层析从大肠杆菌细胞裂解液中纯化出GST-GNP的融合蛋白,其分子量为37.80xa0kDa,再通过前切割蛋白酶进行柱内一步式消化,洗脱获得GNP蛋白前体,其分子量为11.80xa0kDa。图9显示了GNP蛋白前体的SDS-PAGE凝胶电泳结果(凝胶采用SimplyBlue?xa0SafeStain染色)。通过细菌蛋白酶的作用,可使GNP蛋白前体发生蛋白裂解,进一步得到GNP成熟肽。本发明也可采用其他原核表达系统来进行表达和纯化,例如,可采用了带有Poly-His标签的表达质粒,它们广泛用于获得纯化的重组蛋白;还可选用以下表达载体:pET、pUCH33等,或者商业化销售的其他载体;选用以下原核表达菌株:大肠杆菌BL21、大肠杆菌JM109等,或作为或者商业化销售的其他宿主细胞。本发明也可采用其他真核表达系统来进行表达和纯化,例如,选用以下胞内型载体:PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10xa0、PGAPZ,或者选用以下分泌型载体:PPIC9K、PPICZα、PGAPZα,或者商业化销售的其他载体;选用以下真核表达菌株或细胞:毕赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163等,或作为或者商业化销售的其他宿主细胞。实施例七:药物制剂本发明可以将实施例六所制备的重组GNP作为活性成分,或者将实施例二所制备的人工合成GNP作为活性成分,调配于药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂中,调整至灌装浓度,过滤除菌、除热原、灌装,制成注射剂,进一步可制成冻干粉针剂。有关工艺可参考本领域的药学常规工艺。参照目前国内外对于重组人脑利钠肽药品的研究和应用,本发明所制备的重组GNP药品以及人工合成GNP药品,经临床试验后,也可用于制备治疗急性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、急性心肌梗死冠状动脉介入术后患者、慢性心力衰竭、老年急性前壁心肌梗死合并收缩性心力衰竭患者的药物。序列表(SEQUENCExa0LISTING)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0<110>xa0xa0叶亮;陈光明;王洪敏xa0<120>xa0xa0一种利钠肽及其基因与用途xa0<130>xa0xa0<160>xa0xa06xa0xa0xa0xa0xa0<170>xa0xa0PatentInxa0versionxa03.5xa0<210>xa0xa01<211>xa0xa0125<212>xa0xa0PRT<213>xa0xa0Dendroaspisxa0angusticepsxa0<400>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<210>xa0xa02<211>xa0xa0718<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0Dendroaspisxa0angusticepsxa0<400>xa0xa01xa0gaggcaaacgxa0agcgtagctcxa0gacgagagacxa0gctcctgcagxa0cgacagcaccxa0cggctcggctxa0xa0xa0xa0xa060xa0ctcttcggctxa0cagctggtccxa0gcaccctcgaxa0ggattcatctxa0ctctctctctxa0ctctctctctxa0xa0xa0xa0xa0120xa0tccacctgcaxa0cttccgcagcxa0ccggggaagxa0atgxa0gtcxa0ggcxa0ctcxa0tccxa0cgtxa0ctgxa0tcgxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0173xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Metxa0Valxa0Glyxa0Leuxa0Serxa0Argxa0Leu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